Главная >  Публикации 

 

Методы лабораторной диагностики



Жировая ткань является местом образования фактора, который ингибирует действие инсулина. S. Hotamisligil и B. Spiegelman (1994) установили, что таким веществом является a-фактор некроза опухолей. Инсулинорезистентность сопровождается повышением экспрессии в жировой ткани мРНК a-фактора некроза опухолей. Нейтрализация a-фактора некроза опухолей приводит к улучшению действия инсулина в скелетных мышцах и жировой ткани, тогда как в печени этого эффекта не наблюдается. B. A. Maddux и соавт. (1995) описали ещё один механизм инсулиновой резистентности при ИНЗД. Ими был идентифицирован белок, названный гликопротеин 1 плазматической мембраны (РС 1) с молекулярной массой 115-135 кДа, который снижает активность киназы рецептора к инсулину. Интересные данные, проливающие свет на механизмы наследования инсулиновой резистентности, получили C. Reynet и C. Kahn (1993). Они идентифицировали мРНК, которая избыточно экспрессируется в мышцах больных ИНЗД. Эта мРНК кодирует небольшой ГТФ-связывающий белок, названный ими rad (ras, сочетающийся с диабетом). Подобно ras белку rad белок связывает ГТФ (гуанидин трифосфат). Исследования в этой лаборатории (J. Zhu и соавт., 1995) показали, что rad является уникальным белком, внутриклеточный уровень которого повышается в мышцах больных диабетом, каким то образом участвуя в механизмах инсулинорезистентности. Следует отметить, что повышение rad белка выявляется лишь у части больных, страдающих сахарным диабетом II типа.

Как указывалось выше, обязательным компонентом патогенеза ИНЗД является нарушение функции b-клеток. Дисфункция b-клеток развивается как результат совместного воздействия нескольких факторов. Во-первых, это глюкозотоксичность, т.е. состояние длительной, хронической гипергликемии, которое приводит к снижению секреторного ответа b-клеток на стимуляцию повышенным уровнем глюкозы в крови. Это проявляется как снижением или полным отсутствием первой фазы секреции инсулина, так и нарушением пульсирующей секреции инсулина. Во-вторых, установлено, что при ИНЗД имеет место снижение массы b-клеток. Отмечается нарушение конверсии проинсулина в инсулин. У больных ИНЗД изменяется отношение проинсулина к интермедиатным формам инсулина (в сторону увеличения последних), которые, как и сам проинсулин, обладают лишь незначительной сахароснижающей активностью (приблизительно 5-10% по сравнению с инсулином). Показано также, что при диабете II типа снижается количество глюкозного транспортера II типа (ГЛЮТ-2), который является единственным транспортером глюкозы, оперирующим в b-клетках. Правда, у диабетических животных количество ГЛЮТ-2 уменьшалось лишь на 40-80%, что является достаточным для сохранения нормального поступления глюкозы в b-клетку. Однако, по данным A. Valera и соавт. (1994), трансгенные мыши с низким (до 80%) уровнем ГЛЮТ-2 становились диабетическими.

Одной из причин дисфункции b-клеток может быть нарушение глицерин-фосфатного шунта, который является важным сигнальным механизмом в глюкозостимулированной секреции инсулина. Снижение митохондриальной глицерин-фосфат дегидрогеназы выявлено как у экспериментальных диабетических животных, так и у больных ИНЗД.

Глюкокиназа является одним из важнейших ферментов, регулирующих метаболизм глюкозы в b-клетках. Мутации гена глюкокиназы выявляются почти у 50% больных, страдающих диабетом, так называемым MODY типом (диабет взрослого типа у молодежи). К настоящему времени описано более 20 различных точечных мутаций гена глюкокиназы.

Важным открытием последних лет явилась идентификация мутаций митохондриального гена как причина диабета. Митохондриальная ДНК, состоящая из 16569 пар оснований, кодирует 13 ферментов окислительного фосфорилирования. Её мутация обычно касается лейцина тРНК или так называемой мутации tRNALeu(UUR). Впервые такая точечная мутация митохондриальной ДНК была описана при MELAS cиндроме (митохондриальная миопатия, лактат ацидоз, энцефалопатия и инсультоподобные эпизоды), который часто встречается в Японии (A. Chomyn и соавт., 1992). Составляющей частью указанного синдрома является наличие ИЗД или ИНЗД с сенсорной потерей или без потери слуха (T. Kadowaki и соавт., 1994), которая, как правило, развивается после клинической манифестации диабета. Интересно, что ИЗД при этом синдроме (был проведен скрининг 55 лиц, имеющих явный ИЗД или указания в анамнезе о наличии его у других членов семьи) протекает по типу медленно прогрессирующего ИЗД, т.е. вначале диабет манифестируется в виде ИНЗД, а затем присоединяются симптомы инсулиновой недостаточности с наличием аутоантител к антигенам островка поджелудочной железы. Изучая 27 больных с таким медленно прогрессирующим типом ИЗД, Y. Oka и соавт. (1993) у 3 из них (11%) выявили митохондриальную точечную мутацию нуклеотида 3243 (tRNALeu(UUR)), тогда как у 50 здоровых лиц и 30 больных ИНЗД таковая мутация отсутствовала.

Среди других причин, влияющих на нарушение функции b-клеток при ИНЗД, следует отметить нарушение гена, кодирующего IRS-1 (субстрат-1 для инсулиновой рецепторной киназы); нарушение гена, локализованного на 4q хромосоме и кодирующего FABP-2 (2-й белок, связывающий жирные кислоты). Кроме того, имеются данные о том, что мутация гена гликогенсинтазы, точечные мутации гена b3-адренорецептора, точечные мутации 2-го экзона гена рецептора к глюкагону вовлечены в патогенез нарушения функции b-клеток и патогенез ИНЗД.

Хроническая гипергликемия снижает способность b-клеток отвечать секрецией инсулина на острую стимуляцию глюкозой. Такая развившаяся “слепота” b-клеток к глюкозе сопровождается нарушением первой и второй фазы секреции инсулина. Выявленные нарушения секреции инсулина при хронической гипергликемии полностью обратимы при нормализации углеводного обмена. Это явление, т.е. способность хронической гипергликемии нарушать секрецию инсулина, получило название токсичности глюкозы, или глюкозотоксичность.

Нарушение чувствительности b-клеток к глюкозе является следствием десенситизации, которая связана с нарушением активности фосфолипазы С, гидролиза мембранных фосфоинозитидов и уменьшением образования инозитолтрифосфата и диацилглицерина. Не исключается, что феномен десенситизации связан с повышенным образованием в островках поджелудочной железы простагландина Е2, ингибирующего секрецию инсулина.

Феномен глюкозотоксичности объясняет клинические наблюдения, показывающие, что нормализация уровня глюкозы у больных диабетом с помощью диеты, препаратов сульфонилмочевины или инсулина приводит к улучшению секреции инсулина, которая может поддерживаться в течение некоторого времени даже при перерыве в лечении.

Глюкозотоксичностью, видимо, объясняется феномен “медового периода” при ИЗД, когда у вновь выявленных больных сахарным диабетом I типа после начала инсулинотерапии и нормализации при этом углеводного обмена наблюдается улучшение течения диабета при снижении дозы или даже полной отмене инсулина. Теория глюкозотоксичности может объяснить в какой-то степени явление вторичной резистентности больных диабетом II типа к пероральной терапии препаратами сульфонилмочевины. Такая вторичная недостаточность может быть следствием десенситизации b-клеток к стимулирующему влиянию этих препаратов на секрецию инсулина. Нормализация углеводного обмена инсулинотерапией восстанавливает чувствительность b-клеток к глюкозе, и в дальнейшем такие больные могут быть переведены на лечение препаратами сульфонилмочевины.

Рядом исследований показано, что дериваты циклооксигеназы, главным образом простагландин Е2, угнетают ответ инсулина на стимуляцию глюкозой, тогда как производные липооксигеназы, главным образом 15-НРЕТЕ, стимулируют секрецию инсулина. Такие препараты, как колхицин или фуросемид, усиливающие синтез простагландинов, снижают секрецию инсулина, а нестероидные противовоспалительные препараты, главным образом салицилаты, угнетающие циклооксигеназу, повышают ответ инсулина на различные стимуляторы. Предполагают, что при ИНЗД повышается чувствительность к эндогенным простагландинам, что и является основной причиной нарушения секреции инсулина при этой патологии.

MODY-тип (сахарный диабет взрослого типа у молодежи, или “масонский тип” диабета) также является гетерогенным заболеванием. Молекулярно-генетические исследования показали наличие по крайней мере 3 синдромов: MODY-1 (сочетается с нарушениеми 20q хромосомы), MODY-2 (сочетается с различными мутациями гена глюкокиназы на 7р хромосоме) и MODY-3 (сочетается с нарушениями 12q хромосомы).

Выявлено несколько (около 10) семей в мире, у которых сахарный диабет II типа сочетался с различными мутациями гена инсулина, приведшими к различным замещениям аминокислот в молекуле инсулина (инсулин Чикаго- замещение в В25 фенилаланина на лейцин; инсулин Лос-Анджелес – замещение фенилаланина в В24 на серин; инсулин Вакаяма – замещение валина в А3 на лейцин) или нарушению структуры в молекуле проинсулина: в 2 случаях (проинсулин Токио и Бостон) аргинин в положении 65 был замещен на гистидин, что приводило к нарушению конверсии проинсулина в инсулин; и в одном случае (проинсулин Провиденс) выявлено замещение гистидина на аспарагиновую кислоту в положении В10, что также нарушает конверсию проинсулина в инсулин.

Представленные материалы еще раз подтверждают, что в патогенезе сахарного диабета любого типа участвуют одновременно несколько механизмов, степень выраженности которых различна при определенных типах указанной патологии.

Методы лабораторной диагностики

Гликемия. Нормальное содержание глюкозы в крови натощак при определении глюкозооксидазным или ортотолудиновым методом составляет 3,3-5,5 ммоль/л (60-100 мг/100 мл), а при определении методом Хагедорна-Йенсена – 3,89-6,66 ммоль/л (70-120 мг/100мл). По данным ВОЗ (1980), у взрослых нормальный уровень глюкозы в плазме, полученной из венозной крови натощак, 6,4 ммоль/л (<115 мг/100 мл), в цельной венозной крови – 5,6 ммоль/л (< 100мг/100мл) и в цельной капиллярной крови – 5,6 ммоль/л (<100мг/100мл).

Как показали исследования последних лет, с возрастом нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови увеличивается, поэтому после 60 лет необходимо проводить коррекцию, которая составляет 0,056 ммоль/л (1 мг/100 мл) на каждый последующий год. У практически здоровых лиц престарелого возраста гликемия натощак может составлять от 4,4 до 8,0 ммоль/л (80-145 мг/100мл).

Диагностическим критерием сахарного диабета является повышение концентрации глюкозы в плазме венозной и капиллярной крови натощак >7,8ммоль/л (140 мг/100 мл) или в цельной венозной или капиллярной крови >6,7 ммоль/л (120 мг/100 мл); через 2 ч после нагрузки 75 г глюкозы уровень глюкозы в плазме венозной крови > 11,1 ммоль/л (200 мг/100 мл) и в плазме капиллярной крови >12,2 ммоль/л (220мг/100 мл); в цельной венозной крови >10,0 (180мг/100 мл) и в цельной капиллярной крови >11,1ммоль/л (200 мг/100мл).

Нарушенная толерантность к глюкозе, или латентный сахарный диабет, характеризуется следующими показателями: натощак концентрация глюкозы в плазме венозной или капиллярной крови составляет <7,8 ммоль/л (140 мг/100 мл), а в цельной венозной или капиллярной крови <6,7 ммоль/л (120 мг/100 мл). Через 2 ч после приема 75 г глюкозы эти показатели соответственно составляют 7,8-11,0 ммоль/л (140-199 мг/100 мл) в плазме венозной крови и 8,9-12,1 ммоль/л (160,0-179,0 мг/100 мл) в плазме капиллярной крови; тогда как в цельной венозной крови – 6,7-9,9 ммоль/л (120-179 мг/100мл) и в цельной капиллярной крови – 7,7-11,0 ммоль/л (140-199 мг/100 мл).

Повторное (через определенный промежуток времени) увеличение концентрации глюкозы в плазме, полученной из венозной или капиллярной крови, выше 7,8 ммоль/л либо в цельной венозной или капиллярной крови выше 6,7 ммоль/л является признаком сахарного диабета, и в этом случае нет необходимости проводить тест на толерантность к глюкозе.

При повышении уровня глюкозы в крови выше 8,88 ммоль/л появляется глюкозурия, которая вместе с гипергликемией служит объективным критерием заболевания. В редких случаях глюкозурия может отмечаться при нормальной концентрации глюкозы в крови вследствие снижения порога проходимости канальцев почек для глюкозы (почечный диабет). Такая нормогликемическая глюкозурия может быть первичной (идиопатическая) или вторичной (при заболеваниях почек). Она может также встречаться при беременности и синдроме Де Тони-Фанкони-Дебре (ферментная тубулопатия, при которой отмечается нарушение реабсорбции глюкозы, аминокислот, фосфатов и бикарбонатов в почечных канальцах). При сахарном диабете, сочетающемся с нефросклерозом (или функциональной недостаточностью почек другой этиологии), при высокой гипергликемии, наоборот, выявляется минимальная глюкозурия или ее отсутствие. С возрастом наблюдается повышение почечного порога для глюкозы, поэтому у больных сахарным диабетом II типа компенсацию углеводного обмена лучше контролировать по содержанию глюкозы в крови (гликемия), а не по экскреции глюкозы с мочой (глюкозурия).

В том случае, если отсутствуют клинические симптомы диабета, а уровень глюкозы в крови ниже указанного выше, для выявления сахарного диабета проводят пробу на толерантность к глюкозе (ПТГ) с однократным приемом глюкозы. Комитет экспертов ВОЗ (1980,1985) рекомендует применять нагрузку глюкозой в количестве 75 г (у детей – 1,75 г на 1 кг идеальной массы тела, но не более 75 г) с последующим взятием крови в течение 2 ч.

Нарушенная толерантность к глюкозе характеризуется следующими параметрами.

1. Концентрация глюкозы натощак должна быть ниже тех значений, которые расцениваются как диабет, т.е. уровень глюкозы в плазме венозной крови не выше 7,8 ммоль/л, в венозной цельной и капиллярной крови не выше 6,7 ммоль/л.

2. Уровень глюкозы через 2 ч после приема 75 г глюкозы не должен находиться между нормальными значениями и цифрами, характерными для диабета, а именно в плазме венозной крови 7,8- 11,1 ммоль/л, в цельной венозной крови 6,7-11 ммоль/л и в цельной капиллярной крови 7,8-11,1 ммоль/л.

3. Содержание глюкозы через 0,5, 1 и 1,5 ч должно быть повышенным и составлять в цельной капиллярной крови и плазме венозной крови больше 11,1 ммоль/л и в цельной венозной крови больше 10 ммоль/л.

Определение инсулина и С-пептида в сыворотке крови при проведении ПТГ дает дополнительную информацию о состоянии инсулярного аппарата, которая может иметь прогностическое значение.

Естественно, помимо гликемии, в диагностике заболевания широко используют показатели глюкозурии, которая до последнего времени являлась практически единственным показателем компенсации диабета. Внедрение упрощенных методов определения содержания глюкозы в крови с помощью портативных глюкометров (отечественный глюкометр “Сателлит”), а также индикаторных полосок для визуального определения позволяет проводить постоянный контроль за состоянием углеводного обмена у больных диабетом.

Кетонурия или ацетонурия. При недостаточности инсулина наблюдается накопление “кетоновых тел” – продуктов метаболизма жира: b-гидроксимасляная кислота, ацетоуксусная кислота и ацетон. Наличие кетоновых тел в моче свидетельствует о декомпенсации сахарного диабета и диктует необходимость изменения инсулинотерапии. Следует отметить, что кетонурия может встречаться, помимо диабета, и при других патологических состояниях: голодании, диете с высоким содержанием жира, алкогольном кетоацидозе и инфекционных заболеваниях, протекающих с высокой температурой.

Микроальбуминурия и протеинурия. У практически здоровых лиц почки экскретируют лишь незначительное количество белка, которое составляет в течение ночи меньше 15 мкг/мин или менее 30 мг в сутки и носит название нормоальбуминурии. Увеличение экскреции альбумина от 20 до 200 мкг/мин или выше (от 30 до 300 мг/сут) приводит к микроальбуминурии, которая свидетельствует о начальной форме диабетической нефропатии. Экскреция альбумина свыше 300 мг/сут – протеинурия свидетельствует о прогрессировании диабетической нефропатии. В тяжелых случаях высокая протеинурия (3-6 г/сут) сочетается с отеками, гипоальбуминурией, анемией, гиперхолестеринемией, что свидетельствует о нефротическом синдроме.

Гликозилированный гемоглобин или гликогемоглобин. Установлено, что в гемолизатах крови человека наряду с основной фракцией гемоглобина (HbA) содержится незначительное количество других фракций, названных “минорными” (НвА1а, А1b, A1c). У здоровых взрослых на долю НвА приходится 90%, НвА1а-1,6%; НвА1в-0,8%, НвА1с-3,6%; НвА2-2,5% и НвF-0,5%. Гликозилированный гемоглобин – это гемоглобин, в котором молекула глюкозы конденсируется с b-концевым валином b-цепи молекулы НвА. Этот неферментативный процесс протекает медленно, в течение всей жизни эритроцита (около 120 дней). Установлено, что гликозилирование осуществляется через стадию образования альдимина (“шиффовы основания” между альдегидом углеводов и аминогруппой), сравнительно нестойкого, “обратимого” соединения. Далее альдимин посредством химического преобразования (преобразование Амадори) превращается в относительно стойкое, “необратимое” соединение кетоамин. Образовавшийся кетоамин остается присоединенным к белку на весь период его жизни. Гликозилированию подвергаются многие белки организма (белки крови, хрусталика, почек, нервов, сосудов и др.). Скорость гликозилирования и количество гликозилированных белков зависит от величины и длительности гипергликемии.

НвА1с составляет 4-6% общего гемоглобина в крови практически здоровых лиц, тогда как у больных сахарным диабетом уровень этого белка повышен в 2-3 раза. У больных с первично диагностированным сахарным диабетом содержание НвА1с было 11,4±2,5% (в контрольной группе 4,3±0,7%), а после назначения этим больным соответствующей диеты и инсулинотерапии – 5,8±1,2%. Таким образом, гликозилированный гемоглобин имеет прямую корреляцию с уровнем глюкозы в крови и является интегрированным показателем компенсации углеводного обмена на протяжении последних 60-90 дней. Скорость образования НвА1с, так же как и НвА1, зависит от величины гипергликемии, а нормализация его уровня в крови происходит через 4-6 нед после достижения эугликемии. В связи с этим содержание данного белка определяют в случае необходимости контроля углеводного обмена и подтверждения его компенсации у больных диабетом в течение длительного времени. По рекомендации ВОЗ определение содержания гликозилированного гемоглобина в крови боьных сахарным диабетом следует проводить 1 раз в квартал. Этот показатель широко используется как для скрининга населения и беременных женщин для выявления нарушения углеводного обмена, так и для контроля лечения больных сахарным диабетом.

Фруктозамин. Это группа гликозилированных белков крови, а отчасти и тканевых белков. Выше отмечалось, что гликозилирование гемоглобина проходит через стадию превращения альдимина в кетоамин. Кетоамины (белок, содержащий глюкозу) представляют собой фруктозамины. Содержание фруктозамина отражает состояние углеводного обмена за предыдущие 1-3 нед благодаря более короткому периоду полужизни гликозилированных белков крови по сравнению с гемоглобином. В сыворотке крови практически здоровых лиц концентрация фруктозамина составляет 2-2,8 ммоль/л, у больных диабетом при удовлетворительной компенсации углеводного обмена – 2,8-3,2 ммоль/л, а при декомпенсации диабета – выше 3,7 ммоль/л.

Определение других гликозилированных белков. Недостатком методов определения содержания НвА1с, НвА1 и фруктозамина является то, что полученные показатели, свидетельствующие о состоянии углеводного обмена за предыдущие 3-9 нед, не могут быть использованы для краткосрочного контроля за состоянием углеводного обмена у больных после изменения режима инсулинотерапии или других видов лечения. В этой связи продолжается поиск новых возможностей определения количества других гликозилированных белков. Так, M. Hammer и соавт. (1989) предложили новый метод контроля гликемии у больных диабетом – определение содержания гликозилированного фибриногена в крови. Период полураспада фибриногена составляет 4 дня, поэтому количество гликозилированного фибриногена является отражением компенсации углеводного обмена за более короткий период времени по сравнению с уровнем НвА1с или фруктозамина

Далее:

 

Водянка.

Световое излучение ядерного взрыва..

Глава 16. О подростках (13-17 Лет).

Восстановление обоняния.

Глава 6. Чудодейственная водоросль.

О работе.

48.2. Обнаружение следов крови.

 

Главная >  Публикации 


0.0014