Главная >  Публикации 

 

Полимеразная цепная реакция



В таблице 3 представлены данные сравнительного исследования методом ПЦР этих же проб мокроты (диагностические наборы «Политуб» и «Amplicor MTB»), при этом обработка проб и выделение ДНК проводились по методу, предлагаемому к набору «Политуб». Удельный вес совпадений результатов приближался к 100% 14.

Пробы мокроты были предоставлены централизованной бактериологической лабораторией Московского НПЦ борьбы с туберкулезом Комитета здравоохранения Москвы.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 2. Данные сравнительного исследования проб мокроты культуральным методом и методом ПЦР (диагностические наборы «Политуб» и «Amplicor MTB») в соответствии с интрукциями, прилагаемыми к наборам.

(.....)

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 3. Данные сравнительного исследования проб мокроты методом ПЦР (диагностические наборы «Политуб» и «AmplicorMTB») с их обработкой и выделением ДНК по методу, предлагаемому в наборе «Политуб».

(.....)

Диагностический набор «Политуб» прошел клиническую апробацию в клиниках Центрального НИИ туберкулеза РАМН и Новосибирского НИИ туберкулеза Минздрава России.

В таблице 4 приведены данные сравнительного исследования бронхоальвеолярного лаважа больных туберкулезом органов дыхания и неспецифическими заболеваниями легких методами ПЦР и бактериологического посева.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 4. Данные сравнительного исследования бронхоальвеолярного лаважа больных туберкулезом органов дыхания и неспецифическими заболеваниями легких (НЗЛ) методами ПЦР и бактериологического посева (данные Кузнецова П.В., Киншт В.Н., Новосибирский НИИ туберкулеза МЗ РФ)

(.....)

Как видно из представленных в таблице 4 данных, в группе больных туберкулезом бронхов методом ПЦР достигнута более высокая чувствительность по сравнению с культуральным посевом. У больных деструктивными формами болезни с массивным бактериовыделением метод ПЦР имел незначительное преимущество перед культуральным, при недеструктивных формах снова проявляется преимущество молекулярно-биологических методов диагностики. Исследование биопроб у лиц контрольной группы с НЗЛ не выявило МБТ обеими методами.

В таблице 5 представлены данные сравнительного исследования плеврального экссудата методами ПЦР и бактериологического посева, проведенные с целью дифференциальной диагностики туберкулезного и нетуберкулезного плевритов.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 5. Данные сравнительного исследования плеврального экссудата методами ПЦР и бактериологического посева, проведенного с целью дифференциальной диагностики туберкулезного и нетуберкулезного плевритов (Новосибирский НИИ туберкулеза МЗ РФ).

(.....)

Благодаря применению ПЦР у всех больных туберкулезным плевритом в экссудате были выявлены микобактерии, у лиц с неспецифическим плевритом оба метода дали отрицательный результат.

При сравнении чувствительности ПЦР с культуральным исследованием она варьирует от 70 до 95%. Эти результаты находятся в прямой зависимости от качества питательных сред и количества сделанных посевов. Сравнение высеваемости микобактерий с использованием двух или трех питательных сред с данными, полученными методом ПЦР, показывает его недостаточную чувствительность. В работах, где для посева используется одна среда Левенштейна-Йенсена, чувствительность ПЦР выше культурального метода. 13, 15.

Комбинированное применение молекулярно-биологических и культуральных методов значительно повышает эффективность выявления МБТ по сравнению с изолированным применением бактериоскопии и посева на плотные питательные среды (табл.6). Как видно из представленной таблицы, при посеве на плотную среду у подавляющего большинства больных, бактериоскопически абациллярных после проведенного курса химиотерапии, микобактерии дали рост только на 30-60 день. При посеве мокроты на жидкую питательную среду рост микобактерий отмечен у всех 19-ти больных в более ранние сроки – на 16-30 день. Методом ПЦР ДНК микобактерий были выявлены в первый день исследования, но только у девяти человек из 19-ти. Посев мокроты на жидкую питательную среду с последующей детекцией ДНК методом ПЦР позволили выявить микобактерии в достаточно короткий срок (3-18 дней) у остальных десяти больных 23 .

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 6. Сравнительные исследования мокроты методами бактериоскопии, посева на плотную (Левенштейна-Йенсена) и жидкую (BBL MGIT) питательные cреды, ПЦР у 19-ти абациллярных (по данным бактериоскопии) больных (отдел микробиологии ЦНИИ туберкулеза РАМН)

(.....)

В настоящее время метод ПЦР еще недостаточно адаптирован для исследования биопроб при внелегочных локализациях туберкулезного процесса (моча, ликвор, кровь, биоптаты, экссудат), характеризующихся низким содержанием микобактериальной ДНК. Более адекватной интерпретации данных ПЦР-исследования будут способствовать применение различных способов выделения ДНК и режимов амплификации, одновременное исследование различных биологических образцов от одного больного, применение туберкулино-провокационных проб 5, 6, 7, 8.

В клинико-диагностической лаборатории НПФ «Литех» была проведена адаптация набора «Политуб» для диагностики урогенитального туберкулеза, характеризующегося олигобациллярностью (от 2 до 10 клеток в пробе мочи) интермиттирующего характера .

Было проведено исследование мочи от 95 больных, находящихся на обследовании в противотуберкулезном диспансере г.Королева, Российском НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, Российской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ (РМАПО). Из них верифицированный туберкулез мочеполовой системы имели 20 человек, нетуберкулезные изменения мочеполовой системы - 31, туберкулез органов дыхания в сочетании неспецифическими заболеваниями легких – 10, туберкулез внутригрудных лимфоузлов – 25, дети с «виражом» туберкулиновой реакции – 8, туберкулезный увеит –1.

После предварительной подготовки проб (низкоскоростное центрифугирование и прогревание) проводили обнаружение МБТ с использованием диагностического набора «Политуб». Параллельно с проведением диагностики методом ПЦР мочу от тех же больных исследовали традиционными методами (люминесцентная микроскопия, бактериологический посев) в РНИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ и РМАПО МЗ РФ.

Выявление МБТ в моче возможно только при очень высокой чувствительности анализа. Существует два способа повышения чувствительности метода ПЦР. Один предполагает более полное выделение ДНК МБТ, другой – повышение чувствительности амплификации.

Повысить чувствительность амплификации можно двумя путями: увеличить количество циклов одностадийной ПЦР до 45-ти или провести двухстадийную ПЦР, используя помимо внешних внутренние праймеры ("nested-PCR").

Для определения чувствительности разных путей амплификации была проведена ПЦР с использованием контрольной ДНК. С этой целью было сделано стандартное разведение контрольной ДНК Mycobacterium bovis BCG деионизованной водой от 10 ng до 1 fg ДНК в пробе. Для определения оптимальных условий получения необходимой чувствительности решено поставить реамплификацию во 2-ой стадии на 5, 10 и 15 циклах (Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 7).

По результатам исследования были подобраны оптимальные условия выделения и амплификации ДНК-матрицы, с помощью которых проведено исследование 103 клинических образцов.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 7. Определение чувствительности ПЦР при различных режимах амплификации

(.....)

Из приведенной таблицы видно, что фрагмент ДНК при использовании одностадийной амплификации слабо выявляется при концентрации его в пробе 5 и 10 fg и четко выявляется при наличии ДНК в количестве 100 fg и более. Такую чувствительность нельзя признать достаточной при диагностике олигобациллярных форм туберкулеза. Использование двухстадийной ПЦР приводит к повышению чувствительности до 5 fg только при 10 и 15 циклах реамплификации, в связи с чем в последующих исследованиях применяли именно такие условия постановки реакции.

Таким образом, использование двухстадийной ПЦР позволяет достоверно выявлять ДНК микобактерий туберкулезного комплекса, так как амплификация с использованием в качестве матрицы полученного на 1-ой стадии внутреннего фрагмента является аналогом гибридизации. Реамплификация повышает чувствительность выявления патогена в тех случаях, когда он находится в клиническом материале в единичных экземплярах и не выявляется при помощи других методов диагностики.

В таблице 8 приведены данные сравнительного исследования мочи методами ПЦР и бактериологического посева при туберкулезных и нетуберкулезных заболеваниях различных локализаций.

Низкий удельный вес выявления микобактерий туберкулеза методами ПЦР и бактериологического посева у лиц с верифицированным туберкулезом мочеполовой системы объясняется эрадикацией микобактерий вледствие проводимой на момент обследования химиотерапией. Выявление методом ПЦР МБТ в моче при туберкулезе легких, внутригрудных лимфоузлов, туберкулезном увеите и тубинфицированности детей объясняется гематогенным заносом возбудителя из других, пораженных активным процессом органов. Наличие микобактерий в моче на фоне неспецифических воспалительных заболеваний мочеполовой системы свидетельствует о невыявленном инфицировании или неактивном туберкулезном процессе .

Вишневская Е.Б. 6 при исследовании образцов тканей от больных нетуберкулезными заболеваниями костей и гениталий, имеющих одновременно активный туберкулез иного, чем исследуемый орган, в 30-40% случаев методом ПЦР выявила микобактерии туберкулеза. При неактивном туберкулезе или тубинфицировании положительные результаты ПЦР-исследования таких образцов наблюдались в 20-30% случаев.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 8. Сравнительные исследования мочи методами ПЦР (набор " Политуб" ) и бактериологического посева, проведенные с целью дифференциальной диагностики туберкулезных и нетуберкулезных заболеваний различных органов (ПТД г. Королева, РНИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, кафедра туберкулеза РМАПО МЗ РФ)

(.....)

Таким образом, при интерпретации результатов ПЦР-анализа для дифференциальной диагностики мочеполового туберкулеза необходимо учитывать наличие туберкулеза других органов и фазу активности процесса.

В таблице 9 приведены данные сравнительного исследования ликвора методами ПЦР (набор “Политуб”) и бактериологического посева, проведенные в клинике Новосибирского НИИ туберкулеза МЗ РФ (Кузнецов П.В., Киншт В.Н.)

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 9. Сравнительные исследования спинномозговой жидкости методами ПЦР и бактериологического посева, проведенные с целью дифференциальной диагностики туберкулезного и нетуберкулезного менингитов (Новосибирский НИИ туберкулеза МЗ РФ)

(.....)

Как видно из представленной таблицы, у 87,7% больных туберкулезным менингитом методом ПЦР в ликворе были выявлены МБТ, культуральным – только в 37,5% случаев. У лиц с неспецифическим менингитом микобактерии не были выявлены обоими методами.

В таблице 10 представлены данные сравнительных исследований мочи, проведенных с целью дифференциальной диагностики туберкулезных и нетуберкулезных поражений органов мочеполовой системы.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 10. Сравнительное исследование мочи методами ПЦР и бактериологического посева, проведенные с целью дифференцильной диагностики туберкулезных и нетуберкулезных заболеваний мочеполовой системы (данные Новосибирского НИИ туберкулеза МЗ РФ)

(.....)

У лиц с верифицированным в дальнейшем туберкулезом в 84,2% случаев методом ПЦР были выявлены ДНК микобактерий, культуральным методом - только в 5,3%. У значительного контингента лиц ПЦР-исследование позволило отвергнуть туберкулезную этиологию изменений.

Туберкулиново-провокационные пробы основаны на подкожном введении в организм туберкулина (сгущеннной культуральной жидкости от микобактерий туберкулеза, содержащей в качестве активного начала туберкулопротеины, полученные при аутолизе микобактерий) и оценке возникающих после введения реакций: реакции со стороны организма в целом (общая реакция), кожи в месте инъекции (уколочная реакция) и реакция со стороны пораженного специфическим процессом органа (очаговая реакция). В настоящее время наиболее широко применяется так называемая проба Коха, представляющая собой подкожное введение туберкулина АТК или

ППД-Л в дозе от 20 до 100 ТЕ. Оценка степени очаговой реакции со стороны пораженного органа наиболее значима с клинической точки зрения. Во фтизиурогинекологии применяются количественные методы анализа клеточных элементов осадка мочи – определение динамики минутной лейкоцитурии (проба Амбурже) до и после подкожного введения туберкулина. Достоверным признаком активного туберкулеза является возрастание минутной лейкоцитурии в 3 – 5 раз, в то же время при исходной пиурии проба может недостоверной. В клинике внелегочного туберкулеза нашли свое применение и другие модификации пробы Коха: туберкулиново-гемическая, туберкулиново-белковая, туберкулиново-иммунологическая, туберкулиново-иммунохимическая, туберкулиново-ренографическая и другие пробы.

Кузнецов П.В., Киншт В.Н. (Новосибирский НИИ туберкулеза МЗ РФ) предложили исследовать биопробы мочи методом ПЦР через 48 часов после введения 50 ТЕ туберкулина ППД-Л. В таблице 11 приведены данные сравнительного исследования мочи больных туберкулезом мочеполовой системы с целью определения активности процесса. У лиц с активным туберкулезом методом ПЦР в 73,9% случаев были выявлены МБТ, культуральным - в 8,7%. У лиц с неясной активностью процесса после проведения пробы Коха с 50 ТЕ через 48 часов в 59,7% случаев были выявлены МБТ и лишь в 6,5 % -культуральным.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 11. Сравнительное исследование мочи методами ПЦР и бактериологического посева, проведенные у лиц больных туберкулезом органов мочеполовой системы с целью определения активности процесса (данные Новосибирского НИИ туберкулеза МЗ РФ)

Форма туберкулеза, Фаза активности

Кол-во биопроб

Выявление ДНК МБТ методом ПЦР кол-во биопроб)

Выявление МБТ методом бак.посева (кол-во биопроб)

Туберкулез почек,активный

17 (73,9%)

3 (8,7%)

Туберкулез мочеполовой системы с неясной активностью (через 48 часов после проведения пробы Коха с 50 ТЕ)

46 (59,7%)

5 (6,5%)

Как следует из представленных данных, применение туберкулиново-провокационной пробы значительно усиливает диагностическую значимость ПЦР-исследования при туберкулезе мочеполовой системы.

Очень интересными являются данные молекулярно-биологических исследований, подтверждающие гематогенную диссеминацию туберкулезного процесса.

Выделение ДНК МБТ из крови и биоптатов представляет определенные трудности из-за большого содержания в них ингибиторов ПЦР - гепарина и гемоглобина. В связи с этим следует подбирать оптимальный способ выделения ДНК для каждого диагностического образца.

В лаборатории молекулярной диагностики ЦНИИ туберкулеза РАМН использовались три способа - с разрушением клеточной стенки гуанидином, фенол-хлороформный и с использованием протеиназы К. Для оценки и сравнения эффективности различных способов выделения ДНК возбудителя были исследованы биоптаты почек, печени, легкого, селезенки и кровь от лабораторных животных (морских свинок и мышей). Заражение их производилось интраперитонеально культурами МБТ и забой осуществляли через три месяца. Фенол-хлороформный способ выделения ДНК из биоптатов различных органов экспериментально зараженных туберкулезом животных оказался самым эффективным. Удельный вес положительных реакций здесь варьировал от 81,48% (селезенка) до 93,3% (легкое) - в среднем 86%. Эффективность выделения ДНК из печени, почек и крови составила 84,45%, 82,2% и 8,5% соответственно. Из ткани легкого ДНК успешно выделялась при использовании любого способа экстракции. Наиболее трудно выделялась ДНК микобактерий из крови. Самым эффективным способом выделения ДНК при этом оказался гуанидиновый 22 .

Альварес Фигероа М.В. и соавт. 1 в крови экспериментально зараженных животных методом ПЦР выявляли микобактерии туберкулеза (набор реагентов «АмплиСенс МТБ-ком»). В группе животных, получавших противотуберкулезные химиопрепараты, ДНК МБТ определялись лишь до начала лечения и переставали выявляться в течение первого месяца от начала химиотерапии, несмотря на то, что морфологические исследования свидетельствовали о продолжающемся туберкулезном воспалении различных органов. В группе животных, не получавших лечения, ДНК микобактерий выявлялись в течение всего периода от момента заражения.

Туберкулиново-провокационная проба может вызвать возникновение кратковременной микобактериемии, обусловленной резким повышением сосудистой проницаемости вследствие выброса биологически активных веществ и активации имеющегося очага специфического воспаления с образованием в нем микронекрозов. Выявление методом ПЦР индуцированной введением туберкулина микобактериемии может представлять собой значительную практическую ценность.

В таблице 12 приведены данные сравнительного исследования нативной крови лиц с внелегочными поражениями через 48 часов после проведения пробы Коха с 50 ТЕ в целях подтверждения или исключения их туберкулезной этиологии (Новосибирский НИИ туберкулеза МЗ РФ). Выделение ДНК из крови проводилось методом фенол-хлороформной экстракции.

Как следует из представленных данных у подавляющего большинства лиц с туберкулезным поражением мочеполовой и лимфоидной систем методом ПЦР были выявлены ДНК микобактерии туберкулеза. Специфичность реакции была подтверждена отсутствием их у лиц с нетуберкулезными заболеваниями. Культуральным методом ни у кого из обследованных не были выявлены МБТ.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 12. Сравнительное исследование нативной крови методами ПЦР и бактериологического посева у больных с внелегочными поражениями, проведенные после пробы Коха с 50 ТЕ с целью подтверждения их туберкулезной этиологии (данные Новосибирского НИИ туберкулеза МЗ РФ)

Этиологическая характеристика изменений мочеполовой и лимфоидной систем

Кол-во биопроб

Выявление ДНК МБТметодом ПЦР (кол-во биопроб)

Выявление МБТ методом бак. посева (кол-во биопроб)

Туберкулез мочеполовых органов

24 (70,6%)

Не выявлено

Туберкулез периферических лимфоузлов

4 (66,6%)

Не выявлено

Туберкулез периферических лимфоузлов у детей (на фоне виража туберкулиновой реакции)

10 (83,3%)

Не выявлено

Нетуберкулезные заболевания мочеполовой и лимфоидной систем

Не выявлено

Не выявлено

Калюк А.Н. 16 считает, что в качестве скринингового исследования наряду с микроскопией мазка необходимо проведение ПЦР. Это является экономически целесообразным при расхождении результатов микроскопии и ПЦР более, чем на 5%. При положительном ПЦР-анализе и отрицательном микроскопическом можно начинать противотуберкулезную химиотерапию, не проводя культурального посева. Лица с положительным микроскопическим результатом и отрицательным ПЦР-анализом не должны получать химиопрепараты до момента выделения чистой культуры. Поскольку диагностическая чувствительность ПЦР-исследования не менее, чем на 20% выше микроскопического, то предлагаемая схема не только повышает эффективность диагностики, но и приносит значительный экономический эффект.

По данным Савенкова В.И. и соавт. 21 методом ПЦР в 64 % случаев выявляются микобактерии при негативных результатах бактериологических исследований (набор реагентов «Амплитуб»). Учитывая особую чувствительность метода, можно предположить, что высокий удельный вес положительных результатов по данным ПЦР-исследования при отрицательных данных микроскопии и посева клинического материала является следствием обнаружения ДНК нежизнеспособных микобактерий туберкулеза либо длительным персистированием в организме больного измененных форм МБТ (L-формы).

ДНК микобактерий могут сохраняться в организме клинически излеченного или инфицированного туберкулезом в течение длительного периода времени. Их выявление не может являться единственным подтверждением активности туберкулеза и служит лишь основанием для проведения общепринятых дифференциально-диагностических исследований, дальнейшего наблюдения за больным.

Далее:

 

Как жить не болея и не старея.

В. И. Козлов народы нашей страны. Как и почему изменяется их численность.

Закаливание солнцем.

IV. Артерии позвонков.

Божественный настрой на усиление - омоложение головы.

Внутриностное переливание крови.

Боль каузалгическая и таламическая.

 

Главная >  Публикации 


0.0168