Главная >  Публикации 

 

Плазмиды



На рис. 10.1 объясняются полученные результаты. Фактор F в клетках F+ представляет собой небольшую кольцевую молекулу ДНК. Контакт с клетками F- побуждает ее к быстрой репликации и переносу реплики в клетки F-, благодаря чему они превращаются в клетки F+. Во время этого процесса некоторые гены F+ случайным образом проникают в клетку F--, хотя до сих пор не совсем ясно, как это происходит. Как бы то ни было, в клетках Hfr Рис. 10.1. Перенос ДНК при скрещивании Hfr x F. Клетка Hfr соединяется с клеткой F--, и между ними образуется конъюгационная трубка. Фактор F, встроенный в хромосому Hfr, начинает реплицироваться. Но так как фактор F встроен в хромосому, он заодно запускает репликацию всей хромосомной ДНК. Поэтому в клетку F--переходит копия хромосомы Hfr с генами в линейной последовательности. Как только донорская ДНК проникает в клетку F--, она может спариваться с хромосомой F--и образовывать рекомбинанты с аллелями Hfr в хромосоме F-фактор F встраивается в хромосому бактерии, которая тоже кольцевая, хотя и больше по размеру. Теперь при контакте с F-- фактор F снова начинает переносить свою копию, но поскольку фактор F и бактериальная хромосома представляют собой единое целое, эта копия содержит бактериальные гены, которые передаются последовательно: А, В, С, D и т. д. Конъюгация редко длится так долго (90—100 минут), чтобы произошла репликация всей кольцевой хромосомы вплоть до начала фактора F, поэтому клетки F--, как правило, не так уж часто преобразуются в клетки Hfr.

После конъюгации вновь перенесенная ДНК Hfr рекомбинирует с хромосомой F--, и появляются разнообразные рекомбинанты. Но в данном случае по частоте рекомбинации определяют не общую карту Е. coli и расстояние между генами в единицах, а расстояние в минутах между маркерами. Фактор F может встраиваться в различные места и переноситься в разных направлениях от этой точки; каждое такое встраивание приводит к образованию отдельного штамма Hfr уникального происхождения. Так строят карту различных участков генома. Подробные генетические карты Е. coli (рис. 10.2) и других бактерий были составлены при исследовании всех этих штаммов, а также при помощи других методов, которые будут описаны далее.

Плазмиды

Фактор F — пример так называемой плазмиды, то есть внехромосомного самореплицирующегося генетического элемента с кольцевой структурой. Плазмиды — это своего рода пассажиры в клетке, которые реплицируются при репликации клеточной ДНК. Так как они сами представляют собой часть молекулы ДНК, то в них, как и в вирусах, могут содержаться различные гены, однако в отличие от вирусов плазмиды не образуют внеклеточных частиц (вирионов) ни на одной из стадий своего развития. Многие плазмиды могут переносить свои копии в другие клетки подобно F, но некоторые плазмиды просто располагаются в клетках-хозяевах и не могут самостоятельно переходить из клетки в клетку. Фактор F — это пример подкласса плазмид — эписом, которые могут существовать в клетках хозяев как отдельные элементы или встраиваться в хромосомы хозяев.

Рис. 10.2. Карта хромосомы Е. coli. Единицами служат минуты, то есть промежутки времени, через которые переносятся гены при скрещивании Hfr x F--. Отдельные участки карты с большим количеством известных генов более подробно показаны на внешних сегментах. Более мелкие подробности определяются в процессе трансдукции, о чем говорится далее. Данная карта была опубликована несколько лет назад, и сейчас существуют более подробные карты, которые заняли бы несколько страниц

Факторы резистентности и устойчивость к антибиотикам

В 1955 году одна жительница Японии вернулась из Гонконга с разновидностью дизентерии, вызываемой бактерией рода Shigella. Инфекцию Shigella легко лечить антибиотиками, но эти бактерии оказались устойчивыми сразу к четырем разным антибиотикам: сульфаниламиду, стрептомицину, хлорамфениколу и тетрациклину. Это казалось очень подозрительным, потому что обычно устойчивость к антибиотикам встречается редко. Если бактерии поместить в среду с пенициллином, то устойчивой к нему окажется примерно одна на 107 клеток. Точно так же выживет и одна из 107 клеток в среде со стрептомицином. Если же бактерии поместить в среду с двумя антибиотиками, то можно ожидать, что выживет одна из 1014 клеток. Поэтому одновременная устойчивость к четырем видам химических веществ выглядит почти чудом. Но все же за последующие годы бактерии дизентерии в Японии стали очень устойчивыми к антибиотикам, и количество случаев множественной резистентности многократно возросло. Цумото Ватанабе обнаружил, что множественная резистентность переносится плазмидой с условным обозначением R (от resistance — сопротивляемость), которая ведет себя приблизительно так же, как и фактор F. Сейчас известно много типов R, которые передают сопротивляемость к различным антибиотикам. Факторы R довольно опасны тем, что ими легко заразиться: как и факторы F, они переносятся от резистентной к чувствительной клетке при обычном физическом контакте и к тому же могут проникать в разные виды бактерий. Одно из проведенных в Японии исследований показало, что пропорция резистентных клеток Shigella возросла с 0,2% в 1953 году до 58% в 1965 году — во многом именно из-за фактора R. В целом очень серьезной стала ситуация и во всем мире, как заметила Лори Гаррет в своей книге «Наступающая чума»1. Все больше встречается случаев множественной резистентности к антибиотикам у золотистого стафиллокока (Staphillococcus aureus), в том числе к ванкомицину и метициллину, которые раньше считались надежным средством при лечении таких инфекций. Три вида бактерий, вызывающие серьезные заболевания, Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis и Pseudomonas aeroginosa, сейчас уже невосприимчивы к антибиотикам, с помощью которых с ними боролись раньше. В общем, те инфекции, которые раньше легко излечивались при помощи антибиотиков, становятся все более и более трудными для лечения.

История с плазмидами — очередной пример эволюции (и заодно человеческих ошибок). Эволюция зависит от естественного отбора, и это значит, что в данных условиях окружающей среды выживают те организмы, гены которых позволяют им приспособиться к этим условиям. Если, например, сделать посев бактерий на агар с содержанием стрептомицина, то можно вырастить резистентных мутантов, то есть клетки с фактором R (ген резистентности). Точно так же, если бактерии будут обитать в естественной среде, где часто встречается стрептомицин, образуются штаммы устойчивых бактерий с фактором R.

Ученые обнаружили множество плазмид, передающих устойчивость к различным антибиотикам, включая ампициллин, сульфаниламид, хлорамфе-никол, канамицин, неомицин, стрептомицин, спектиномицин и гентамицин, а также к таким металлам, как ртуть, никель и кобальт. Некоторые из факторов R могут одновременно передавать более десятка генов устойчивости к антибиотикам. Бактерии с фактором R обнаружены в морской рыбе, а сравнительное исследование бактерий в реке Стаут в Англии показало, что с 1970 по 1974 год количество резистентных бактерий увеличилось вдвое, хотя их общее количество осталось неизменным. Отсюда можно сделать вывод, что вследствие широкого распространения антибиотиков происходит отбор факторов R.

Быстрое распространение факторов R, легко преодолевающих межвидовые границы, обещает в недалеком будущем рост других заболеваний. Исследования, проведенные в больнице города Бирмингема, показали, что резистентная к антибиотикам бактерия Pseudomonas, выделенная из желудка пациентов, поступивших в больницу с ожогами, по всей видимости, приобрела факторы R из собственной кишечной флоры пациентов. Вызывает тревогу и тот факт, что антибиотики все чаще используются как пищевые добавки в корм для птицы, свиней, крупного рогатого скота, рыб и других хозяйственных животных. С 1954 по 2002 год производство антибиотиков в США возросло с 2 млн. фунтов до более чем 50 млн фунтов, и по приблизительным оценкам, половина этого количества добавляется в корм животным. Благодаря таким нехитрым методам удается избежать распространения не очень опасных инфекций и увеличить прирост веса. Однако такие добавки приводят к отбору среди бактерий, потому эффективность этого метода постепенно снижается. Для более быстрого роста количество антибиотиков в кормах удваивается и даже утраивается. В результате значительно увеличилась пропорция клеток R среди скота и птицы. Теперь уже более 70% бактериальной флоры у большинства видов скота имеет фактор R. В Великобритании потенциальная опасность передачи факторов R от скота человеку была отмечена в докладе Swann, в котором давались советы значительно уменьшить использование антибиотиков в качестве веществ, способствующих росту животных. В 1998 году Европейский Союз запретил применение антибиотиков, которые одновременно используются и для лечения заболеваний человека. Высокопоставленные ученые и деятели здравоохранения в США потребовали от правительства сделать то же самое. Однако доход от продажи антибиотиков фермерам огромен: в 1983 году он превысил 270 млн. долларов, и североамериканские фармацевтические компании отказались уменьшить производство антибиотиков для сельскохозяйственных животных. Эти компании также успешно борются со всеми попытками принять запрещающие законы. К сожалению, правительство США, даже во времена самых либеральных администраций, всегда принимало сторону фармацевтических компаний и критиковало ограничительные меры Европейского Союза.

Е. С. Андерсон из Великобритании, изучая факторы R, не перестает подвергать критике фармацевтов. Иногда они идут на значительные искажения фактов, как, например, в рекламе препарата Неграм концерна «Винтроп»:

«Зачем давать бактериям фору в 48 часов?» — говорится в одной рекламной статье, которая сообщает, что якобы за два дня, в течение которых происходит подготовка пациента к анализу, от одной резистентной клетки могло бы образоваться 7,9231 х 1028 резистентных бактерий. Любой начинающий микробиолог знает, что такое безграничное размножение (которое на самом деле дало бы не менее 30 000 млн. тонн бактерий) может происходить только в специализированных лабораторных условиях и уж никак не внутри организма. Тем не менее на таком примере «Винтроп» доказывает, что в действительности никаких резистентных бактерий не наблюдается, а следовательно, их продукт безвреден и рекомендован для применения на практике2.

Методы распространения таких продуктов бывают весьма настойчивыми («Самый лакомый кусочек для свиньи») и безответственными. В результате создается благоприятная обстановка для широкого применения сильнодействующих препаратов с факторами R.

Хотя производители утверждают, что их добавки к кормам совершенно безвредны, в 1984 году было получено убедительное доказательство обратного. В феврале 1983 года Майкл Остерхолм из департамента здравоохранения Миннесоты сообщил в Центр контроля заболеваний в Атланте о необычной вспышке желудочно-кишечной инфекции в районе Миннеаполиса и Сент-Пола, вызываемой бактерией Salmonella Newporti. Оказалось, что она резистентна к ампициллину, карбенициллину и тетрациклину и что во всех образцах бактерии встречаются одни и те же плазмиды. О другой вспышке инфекции, вызываемой той же бактерией, сообщил эпидемиолог Кеннет Сенджер из Южной Дакоты. Затем путь распространения этой бактерии проследили до фермы, в которой к кормам регулярно добавляли хлортетрациклин. Мясо животных, употреблявших эти корма, поставляли в супермаркеты Миннесоты, где его и приобрели будущие жертвы заболевания. Этот случай противоречит утверждениям производителей антибиотиков и фермеров, согласно которым их практика не приводит к отбору резистентных бактерий и не представляет угрозы для здоровья людей.

Налицо очевидная опасность факторов R, и перед ее лицом люди еще раз должны задуматься о том, что стремление получить сиюминутную выгоду может привести к пагубным последствиям в будущем. Штаммы возбудителей сифилиса и гонореи с фактором R могут ухудшить и без того серьезное положение с венерическими заболеваниями.

Таким образом, плазмиды представляют собой мощное средство генетических изменений с непредсказуемыми последствиями. Как мы увидим далее, в генной инженерии плазмиды служат одновременно источником больших надежд и опасений.

Лизогения

Биологи, проводившие эксперименты с фагами до Второй мировой войны, часто утверждали, что некоторые штаммы бактерий переносят вирусы, которые иногда непредсказуемо проявляют себя в растущих культурах. Ученые школы Дельбрюка не воспринимали серьезно подобные утверждения и отвергали эти факты, полагая, что бактерии заражались из-за недостаточно стерильных методов работы. Однако в 1950 году Андре Львов и Антуанетта Гутман из Парижа доказали существование явления, названного лизогенией, и содержание неактивных форм фагов, называемых профагами, в некоторых бактериях. Лизогенные штаммы имеют иммунитет против тех фагов, переносчиками которых они являются. Иногда профаг в лизогенной клетке спонтанно индуцируется, то есть переходит в активное, или литическое, состояние. Его ДНК быстро размножается, и клетка наполняется частицами фага, после чего лизирует, то есть разрушается, как если бы она была заражена фагом наподобие Т4. Львов позже обнаружил, что можно индуцировать литическую фазу, подвергнув бактерии воздействию ультрафиолетового света или других реагентов. Так исследователи смогли контролировать рост фагов.

Фаги, существующие в лизогенных бактериях, называются умеренными, в противоположность вирулентным фагам, таким как Т2 или Т4, которые всегда быстро размножаются и убивают своего хозяина. Когда умеренный фаг заражает чувствительную (нелизогенную) клетку, он либо размножается литически, либо становится префагом и преобразует бактерию в лизогенную клетку. Из этой клетки впоследствии может образоваться клон лизогенных клеток, содержащих копии этого профага, так как ДНК профага реплицируется во время репликации хромосомы бактерии. Подобно плазмидам эти профаги переходят из бактерии в бактерию при делении клеток.

В 1951 году Эстер Ледерберг обнаружила, что некоторые штаммы Е. coli лизогенны к фагу лямбда (?), который с тех пор стал самым изученным и самым полезным из вирусов. На его примере удалось понять, где профаги скрываются внутри клетки. Эксперименты по картированию показали, что профаг лямбда располагается на особом участке между генами gal и biо (гены метаболизма галактозы и синтеза витамина биотина). Аллен Кэмпбелл доказал, что профаг лямбда встраивается в этот участок, подобно тому как фактор F встраивается в хромосому бактерии Hfr, так что ДНК профага и ДНК бактерии составляют одну большую молекулу ДНК. Проникший в клетку фаг внедряет в клетку свою кольцевую ДНК. Особый участок ДНК лямбды, которым она прикрепляется к ДНК бактерии, имеет ту же последовательность, что и участок хромосомы Е. coli между генами gal и biо:

После кроссинговера ДНК лямбды становится составной частью ДНК Е. coli. В интегрированном профаге имеется механизм контроля, который держит большинство генов профага в неактивном состоянии, так же как и гены любых проникающих в клетку вирусных геномов, поэтому лизогенные клетки иммунны к большинству вирусов того же типа.

Профаги других умеренных фагов, таких как Р1, не становятся частью хромосомы хозяина, а существуют отдельно, подобно плазмидам. Некоторые вирусы животных также могут существовать в своего рода лизогенном виде внутри клеток хозяина, и иногда этому состоянию соответствуют определенные стадии некоторых болезней. Многие канцерогенные вирусы (те, что вызывают злокачественные опухоли) аналогично встраиваются в хромосомы хозяина.

Гены, переносимые вирусом Пытаясь определить, конъюгирует ли Salmonella подобно Е. coli, Нортон Циндер обнаружил, что фаги могут переносить гены из одной бактериальной клетки в другую. Это явление назвали трансдукцией. Встроенный в ДНК профаг выходит из хромосомы хозяина в процессе кроссинговера, обратного первоначальному. Но иногда кроссинговер происходит не совсем на том же месте, и к фаговой ДНК с одной или другой стороны присоединяются несколько генов бактерии:

Этот кусок ДНК может быть встроен в фаговую частицу, и тогда фаг лямбда станет переносить гены gal или bio в другие клетки. Это так называемая специфическая трансдукция, которая затрагивает лишь некоторые отдельные гены. Другие фаги, подобные Р1, могут осуществлять общую трансдукцию и переносить любые гены. Во время размножения такого фага хромосома бактерии режется на мелкие куски, и иногда один из кусков попадает в головку фага вместо его генома. Затем такой фаг может присоединиться к другой клетке и внедрить в нее содержимое своей оболочки, то есть бактериальные гены. Трансдукция послужила эффективным средством для определения тонкой структуры бактериальных генов и составления карт бактериальных хромосом. Фаги переносят только небольшие кусочки ДНК, и анализ того, каким образом эти кусочки рекомбинируют с новой хромосомой хозяина, позволяет установить последовательность бактериальных маркеров.

Трансдукция и геном человека

В 1955 году Джошуа Ледерберг предположил, что трансдуцирующие вирусы можно использовать для введения генов в клетки человека. В то время такая идея казалась чистой фантазией, но сейчас она все более и более приобретает черты реальности, особенно в свете развития технологии рекомбинант-ных ДНК, описанной в гл. 12.

Трансдукцию можно использовать для того, чтобы: 1) внедрить доминантные «хорошие» гены и исправить наследственный дефектный фенотип; 2) внедрить гены в пищевые растения и увеличить их полезность; 3) изменить бактерии так, чтобы они выполняли полезные биологические функции; 4) вызывать заболевание в определенном организме. Главный технический вопрос заключается в том, могут ли вирусы захватывать гены животных и внедрять их в другие клетки. Ответ на этот вопрос положительный. Например, если вирусом простого герпеса заразить штамм мышиных клеток, в которых отсутствует определенный белок (тимидинкиназа), то у 0,1% клеток появляется нормальный аллель. Нормальный аллель могли привнести только вирусы. Клетки с привнесенным аллелем довольно стабильны и производят тимидинкиназу на протяжении 8 месяцев. В других экспериментах используют аденовирусы и другие вирусы животных, с помощью которых переносят гены, например для лечения генетических заболеваний. Были выведены трансдуцирующие полиомовирусы, которые могут захватывать гены мыши и переносить их в ядро клетки человеческого эмбриона.

Некоторые медицинские технологии иногда разрабатываются до того, как удается определить этические правила их применения. В истории науки так бывало часто, например, когда Бантинг и Бест разрабатывали и тестировали опытные образцы инсулина или когда Кристиан Барнард поразил общественность заявлением об удачной трансплантации сердца. То же можно сказать и о трансдукции генов в клетки человека. В 1958 году Стэнли Роджерс изучал вирус папилломы Шопа, которая вызывает повреждения кожи у кроликов. Он обнаружил у инфицированных клеток высокий уровень содержания фермента аргиназы, вызванный, по всей видимости, генами вируса. В сыворотке крови аргиназа расщепляет аминокислоту аргинин. Затем обнаружилось, что у трети сотрудников лаборатории, работавших с вирусом папилломы Шопа, уровень аргинина меньше обычного. Вероятно, вирус перенес ген аргиназы в клетки людей.

В 1970 году Роджерс узнал о семье из Германии, в которой две сестры (позже родилась третья) страдали от наследственной гипераргинемии, вызванной недостатком аргиназы. В их крови и костном мозге наблюдалось очень высокое содержание аргинина, которое часто приводит к замедлению умственного развития, параличу конечностей и эпилептическим припадкам. Роджерс внутривенно ввел девочкам (в возрасте 2 и 7 лет) вирус папилломы Шопа, а позже ввел его и их пятимесячной сестре. Однако остановить или замедлить развитие заболевания не удалось, и эксперимент сочли неудачным. Тем не менее, он заставляет задуматься, насколько свободно ученые должны экспериментировать с методами, имеющими огромные социальные последствия. Генную терапию попытались применить без всякого представления о вызываемом ею непосредственном эффекте, не говоря уже о долговременных последствиях. Это даже скорее не генная терапия, а технический эксперимент. Фридман и Роблин3 предупреждают, что такое поспешное и необдуманное экспериментирование может «послужить толчком для других попыток в ближайшем будущем», и ратуют за то, чтобы воздержаться от подобных попыток, пока не будет получена дополнительная информация. Роджерс на это возражает:

Далее:

 

Нефрит (болезнь брайта).

Лекция 7 Основные принципы организации психиатрической помощи населению в чрезвычайных ситуациях.

Влияние природного радиоактивного фона на здоровье человека.

162. Крыжовник обыкновенный.

Глава III Методы исследования (взаимоотношение «объяснения» и «понимания» в психологии).

Приложение I. Традиции аа.

Развитие наблюдательности.

 

Главная >  Публикации 


0.0014