Главная >  Публикации 

 

Генодиагностика во фтизиатрии



(Пособие для врачей) Москва 2000

НИИ физико-химической медицины МЗ РФ Центральный НИИ туберкулеза РАМН Новосибирский НИИ туберкулеза МЗ РФ Научно-производственная фирма «ЛИТЕХ»

Е.Г. Бочкарев, Т.С.Денисова, Э.В.Генерозов,В.М. Говорун, Е.Ю.Никитченко, Л.Н.Черноусова, П.В.Кузнецов

Сравнительная характеристика лабораторных методов исследования во фтизиатрии Полимеразная цепная реакция: применение ПЦР для детекции микобактерий туберкулезного комплекса Данные клинического применения во фтизиатрии наборов реагентов, использующих метод ПЦР для детекции М.tuberculosis Возможности генодиагностики в идентификации резистентности микобактерий туберкулезного комплекса к противотуберкулезным препаратам Применение методов генодиагностики в эпидемиологических исследованиях Заключение Литература

Введение

Обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в клинических образцах является одним из основных диагностических подходов во фтизиатрии. В настоящее время традиционные микробиологические методы выявления возбудителя по своей эффективности уже не удовлетворяют клиницистов. Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью: для обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ) необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 тыс. микробных клеток. Люминесцентная микроскопия увеличивает чувствительность бактериоскопии на 10-30%. Чувствительность бактериологического посева значительно выше – 20-100 МБТ, однако, исследование занимает длительное время - один-два месяца. В связи с этим МБТ в нашей стране выявляют в среднем лишь у 50-60% больных активным туберкулезом.

Дальнейшее развитие лабораторных методов исследования во фтизиатрии было обеспечено в первую очередь фундаментальными исследованиями в области химии иммунологии и генетики. В последнее время развиваются методы, объединенные понятием генодиагностика.

Генодиагностика - это комплекс методов, позволяющих обнаруживать последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Генодиагностика - относительно новый раздел диагностики, возникший гораздо позже методов, основанных на микробиологических и иммунологических принципах. Поэтому возможности и области его применения еще не всегда хорошо известны микробиологам, эпидемиологам и фтизиатрам.

Для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях, внутриклеточных паразитов, персистирующих форм микроорганизмов, атипичных форм бактерий наиболее рационально и эффективно применение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

За последние годы в зарубежной печати появились работы, характеризующие ПЦР как метод, обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и быстротой (в течение 4–5 часов) выявления МБТ . Эти преимущества позволяют диагносцировать возбудителя на ранних стадиях заболевания и в различных биологических материалах 27,38,39,40,47.

Внедрение молекулярно-биологических методов уже сейчас позволяет выявлять резистентность к химиопрепаратам и проводить типирование микобактерий туберкулеза в достаточно короткие сроки.

Целью настоящего пособия является оценка места молекулярно-биологических методов диагностики микобактерий туберкулеза в сравнении с традиционными микробиологическими, определение показаний к их применению, интерпретации полученных результатов с клинической точки зрения.

Сравнительная характеристика лабораторных методов исследования во фтизиатрии

Бактериоскопические методы исследования

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, МБТ могут быть обнаружены при наличии не менее 100.000 -1.000.000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала. Такое значительное количество МБТ встречается при распространенных, преимущественно легочных формах заболевания (диссеминированная, фиброзно-кавернозная, цирротическая). Методы накопления (флотация) повышают выявляемость МБТ по сравнению с обычной микроскопией на 10% 17.

Люминесцентная микроскопия при туберкулезе в настоящее время является эффективным бактериоскопическим методом лабораторной диагностики, широко применяющимся в микробиологических лабораториях Российской Федерации. Чувствительность метода люминесцентной микроскопии 10.000 – 100.000 МБТ в 1 мл материала 17.

Культуральный метод исследования

Культуральный метод выявления МБТ дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что МБТ являются в основном медленно растущими организмами, и рост их колоний наблюдают в течение 2-3 месяцев.

Для культивирования микобактерий туберкулеза используют различные питательные среды: агаризованные твердые, полужидкие и жидкие (синтетические и полусинтетические). Для увеличения результативности культурального метода рекомендуется применять посев материала одновременно на несколько (две-три) различных питательных сред. Чаще всего используют посевы на яично-картофельную среду (по Левенштейну-Иейнсену), считающиеся более достоверным способом выявления МБТ. Особое значение приобретает исследование на нескольких питательных средах при внелегочных формах туберкулеза, характеризующихся скудным, в отличие от легочных, бактериовыделением. В настоящее время доказано преимущество одновременного посева мочи на три питательные среды: основная - Левенштейна-Йенсена, дополнительные - среды Фин-II и среда В.А.Аникина.

Продолжительность роста МБТ ограничивает диагностические возможности клиницистов. МБТ выявляются лишь при 52-65% случаев активного туберкулеза легких, а в клинике внелегочного туберкулеза удельный вес их выявления еще ниже. При туберкулезных менингитах лишь в 3% случаев обнаруживается рост микобактерий на питательных средах. Незначительным является удельный вес высеваемости у больных туберкулезом мочеполовой системы. Частота высевания микобактерий туберкулеза при нефротуберкулезе варьирует от 26,7% до 73% случаев 16.

Наблюдаются случаи, когда больные после лечения выделяют значительное количество маложизнеспособных или мертвых МБТ. В таких случаях посевы дают отрицательные результаты, и бактериоскопические методы являются единственными, с помощью которых удается обнаружить возбудителя туберкулеза.

Значительные трудности представляет обнаружение микобактерий у лиц со скудным их выделением. Среди впервые выявленных больных у одной трети бактериовыделение является однократным 17.

В настоящее время во фтизиатрии принята разработанная в Российском НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ комплексная методика исследования мочи на МБТ: из одной и той же порции одновременно выполняется люминесцентная микроскопия ее осадка, окрашенного аурамином, и осуществляется посев материала не менее чем на две питательные среды. Микобактерии, потерявшие кислотоустойчивость, но сохранившие жизнеспособность, лучше выявляются посевом, а потерявшие жизнеспособность, но сохранившие кислоустойчивость - бактериоскопией.

Культуральный метод позволяет проводить определение чувствительности и устойчивости МБТ к противотуберкулезным антибиотикам.

Система вастес

За рубежом широкое распространение получила радиометрическая система ВАСТЕС для быстрого обнаружения живых МБТ в жидкой питательной среде. Микобактерии культивируют в жидкой ВАСТЕС среде, где в качестве источника углерода используется меченая 14С пальмитиновая кислота. При положительных данных бактериоскопического исследования рост МБТ обнаруживали радиометрически на 7-10-й день и на 14-21-й дни при отрицательных данных.

К недостаткам этого метода, ограничивающим возможность его широкого применения, относятся:

* высокая себестоимость исследования;

* необходимость применения радиоактивных изотопов и специального радиометрического оборудования, сложность работы с изотопной технологией;

* необходимость дополнительного посева на плотную питательную среду при возникновении проблем с идентификацией или интерпретацией результатов.

Биологический метод исследования

Биологический метод применяется для выявления не только типичных, но и разнообразных, биологически измененных, форм возбудителя, в частности L-трансформированных и фильтрующихся форм.

Самым восприимчивым к туберкулезной инфекции лабораторным животным является морская свинка. Считается, что ее заражение позволяет диагносцировать туберкулез при наличии в материале, использованном для заражения, 1-5 микробных клеток.

Серьезными недостатками биологического метода являются его высокая стоимость, необходимость специальных условий, длительность проведения анализа и зависимость результатов от чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам. Под их влиянием многие штаммы снижают или теряют свою вирулентность.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) получил широкое распространение в диагностике различных инфекционных заболеваний в связи с высокой чувствительностью и специфичностью анализа, высокой производительностью, простотой проведения анализа и регистрации результатов, возможностью использования микроколичества диагностического материала и автоматизации процесса. ИФА используют для определения как антител, так и антигенов в биологических жидкостях.

В 1976 году E.Nassau с соавт. первыми применили его для серодиагностики туберкулеза, использовав в качестве антигена фильтрат M. tuberculosis H37Rv.

При использовании ИФА специфические антитела выявляются у 80% больных активным туберкулезом, в том числе и костно-суставным. Однако образование антител меняется в зависимости от активности туберкулезного процесса, распространенности и давности заболевания, и в процессе противотуберкулезного лечения.

Несмотря на значительное число публикаций, посвященных применению методов ИФА для серодиагностики туберкулеза, проблема диагностики не является решенной, поскольку чувствительность анализа колеблется от 68 до 92%, а специфичность - от 86 до 97%, то есть число ложноположительных реакций среди здоровых или лиц с нетуберкулезными заболеваниями колеблется от 3 до 14%. Недостаточная специфичность анализа связана с наличием общих антигенов между МБТ и другими непатогенными микобактериями.

Полимеразная цепная реакция

Применение ПЦР для детекции микобактерий туберкулезного комплекса

Метод ПЦР основан на ферментативной амплификации выбранных специфических участков генома бактерий рода Mycobacterium tuberculosis M. bovis, M. africanum, M. microti), их дальнейшей детекции и идентификации. Аналитическая чувствительность метода, определяемая при последовательных разведениях суспензии бактериальных клеток, очень высока и составляет от 1 пг до 5 фг микобактериальной ДНК, что эквивалентно выявлению 1-10 бактериальных клеток.

В настоящее время существует ряд разработок по использованию ПЦР в диагностике туберкулеза, но до сих пор не найдена оптимальная маркерная последовательность в геноме Mycobacterium tuberculosis, обеспечивающая максимальную специфичность и чувствительность анализа, что препятствует широкому применению ПЦР с целью выявления МБТ в практическом здравоохранении.

Для инициирования ПЦР при определении микобактерий туберкулеза в клинических образцах используются различные праймеры. Одни направлены на амплификацию фрагментов ДНК генов, кодирующих микобактериальные антигены, такие как белок теплового шока (белок 65 kD ), антиген b (38 kD) , МРВ 64; другие - на амплификацию повторяемых последовательностей в хромосоме микобактерий туберкулезного комплекса; третьи - на амплификацию рибосомальной РНК.

В 1989 г. A. Brisson-Noel с соавт. одни из первых опубликовали свои материалы, посвященные быстрой диагностике туберкулеза методом ПЦР. Было исследовано 35 клинических образцов (мокрота, содержимое желудка, содержимое абсцесса, периферическая кровь), из которых только два положительных в ПЦР не соответствовали отрицательным результатам, полученным стандартными методами (микроскопия, культуральные исследования). Эти две пробы были получены от больного, который получал в течение четырех недель специфическое лечение. Для постановки реакции были взяты праймеры, подобранные из нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок 65 kD. Выбор данного белка обусловлен тем, что он играет важную роль в детерминировании иммунитета, а также для определения патогенных свойств Mycobacterium tuberculosis. Этот белок широко представлен у различных микобактерий и является перекрестнореагирующим. Ген, кодирующий белок 65 kD, содержит как общие для всех микобактерий участки, так и вариабельные участки, нуклеотидные последовательности которых являются видоспецифическими. В связи с этим, для окончательной идентификации амплифицированного фрагмента, авторы подвергали продукт ПЦР гибридизации. В качестве зонда использовали видоспецифический участок для M.tuberculosis.

Более удачной оказалась маркерная последовательность, кодирующая ген антигена Mycobacterium tuberculosis 38 kD. Этот антиген не является иммунологически значимым для человека, но он высокоспецифичен в отношении микобактерий туберкулезного комплекса. Эта нуклеотидная последовательность представлена в геноме микобактерий туберкулезного комплекса в единственном числе. При оценке специфичности ПЦР R. Yuen с соавт. в качестве мишени выбрали фрагмент гена, кодирующего видоспецифичный для M. tuberculosis белок 38 kD. Тестированию подвергли 31 штамм M. tuberculosis, 15 атипичных микобактериальных видов и некоторых бактерий верхних дыхательных путей. Амплифицированный продукт в 239 н.п. был обнаружен во всех штаммах M. tuberculosis, в стандартных штаммах M. bovis и M.africanum, в других тестируемых штаммах реакция была отрицательной. Используя праймеры, комплементарные последовательности гена белкового антигена 38 kD, Y.Miyazaky с соавт. удалось определить методом ПЦР 100 КОЕ/ мл. При проведении nested ПЦР в течение 35 циклов - 0,1 КОЕ мл.

Использование повторяемых последовательностей в качестве мишени для ПЦР обеспечивает амплификацию с большой чувствительностью, т.к. число копий этих последовательностей в хромосоме микобактерий туберкулезного комплекса колеблется от 9 до 16. При обнаружении МБТ используют повторяемые последовательности IS6110 и IS986, специфичные для микобактерий туберкулезного комплекса. Использование праймеров для синтеза повторяющихся в ДНК МБТ участков обеспечивает большую чувствительность анализа - до 0,1 пг ДНК, т.е. до одного микроорганизма 19. В большинстве случаев чувствительность варьирует от 74 до 91%, а специфичность - от 72 до 100%.

Метод РНК-амплификации используется в ПЦР для амплификации 16S рибосомальной РНК M. tuberculosis. Использование 16S rRNA мишени для ПЦР весьма выгодно, т.к. 16S rRNA - компонент микобактериальных рибосом и экспрессируется в большом количестве копий (от 103 до 104 на клетку). B.Boddinghaus с соавт. показали, что при обратной транскрипции rRNA образуется от 103 до 104 ДНК копий на клетку для амплификации в ПЦР. Кроме того, внутри 16S rRNA гена имеются общие для микобактерий последовательности, что позволяет амплифицировать ДНК для диагностики микобактериальных инфекций. Для дальнейшей идентификации микобактерий необходима гибридизация продукта ПЦР с высокоспецифичными зондами. Чувствительность 16S rRNA тестов достаточно высока (от 82 до 100%), специфичность 99-100%. Однако этот метод технически сложен и трудоемок, требует дорогостоящих реактивов и проведения реакции гибридизации для окончательной идентификации общего продукта ПЦР.

Метод ПЦР может быть также применен для типирования микобактерий в эпидемиологических исследованиях. Так, выявление вариаций в последовательности гена, кодирующего белок 32 kD, а также в последовательности, разделяющей гены 16S и 23S РНК, позволяет проводить идентификацию различных видов M. tuberculosis и штаммов одного вида 18 .

Возможности ПЦР-анализа настолько широки, что позволили обнаружить ДНК M. tuberculosis в останках людей, умерших за 2000-1500 лет до нашей эры, а также у перуанских мумий 1000-летней давности.

На эффективность ПЦР-анализа существенным образом влияет метод обработки клинического материала 5 . В ПЦР-диагностике туберкулеза для исследований обычно используют мокроту, промывные воды бронхов, бронхиальные аспираты, плевральную жидкость, мочу, спинномозговую жидкость, кровь, биоптаты лимфоузлов и других тканей.

Особенно ярко преимущества ПЦР проявляются при внелегочных формах инфекции, когда туберкулезную этиологию заболевания удавалось установить в 26,5% при помощи ПЦР и в 14,5% при культивировании. 7 .

Успешное лечение больных туберкулезом невозможно без контроля за эффективностью химиотерапии. В ходе ее проведения, в то время как результаты культурального и микроскопического методов были отрицательными, с помощью ПЦР удалось обнаружить M. tuberculosis в 27% образцов через 2 мес. после начала лечения, в 13% - через 3 мес. и в 7% - через 6 мес. лечения. 15.

Заболевания, вызванные нетуберкулезными микобактериями (микобактериозы) часто имеют сходную с туберкулезом клинико-рентгенологическую картину. Вследствие этого больные микобактериозоми получают не показанные им химиопрепараты, к которым потенциально патогенные микобактерии имеют резистентность. Ранняя же диагностика микобактериозов и этиотропное лечение, как правило, обуславливают благоприятный исход. Метод ПЦР позволяет дифференцировать виды микобактерий. A. Bahrmand с соавт. при изучении 329 образцов мокроты методом ПЦР использовали праймеры, специфичные для M. bovis, и получили положительный результат в 274 образцах. В то же время при культивировании микобактерии туберкулеза обнаружены в 224 образцах. Для 55 образцов, отрицательных по результатам ПЦР, были использованы праймеры, специфичные для M. fortuitum и M.kansasii. 21 образец из 55 содержали нетуберкулезные микобактерии.

В таблице 1 приведена сравнительная характеристика по чувствительности и продолжительности исполнения микробиологических методов и ПЦР.

Таблица (находится в справочных материалах нашего сайта) 1. Сравнительная чувствительность и продолжительность исполнения различных лабораторных методов выявления микобактерий туберкулезного комплекса

Чувствительность

Продолжительность исследования

Микроскопия с окрашиванием по Цилю-Нильсену

100.000 - 1.000.000 МБТ в 1 мл

1 – 2 часа

Люминесцентная микроскопия

10.000-100.000 МБТ в 1 мл

1- 2 часа

Культуральный посев

20-100 МБТ в 1 мл

1- 2 месяца

1-10 МБТ в 1 мл

5 часов

Данные клинического применения во фтизиатрии наборов реагентов, использующих метод полимеразной цепной реакции для детекции M.tuberculosis

В настоящее время актуальным для здравоохранения является клиническая интерпретация результатов ПЦР-исследований во фтизиатрии. Нами накоплен 4-х летний опыт практического применения разработанного в научно-производственной фирме Литех при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ диагностического набора Политуб, предназначенного для выявления микобактерий туберкулезного комплекса (M. tuberculosis и M. bovis) в широком спектре клинических образцов (мокрота, плевральная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, соскоб эндометрия). Были проведены клинические испытания диагностической системы Политуб в ведущих российских фтизиатрических клиниках. Набор утвержден Министерством здравоохранения РФ 4.11.97 г. и cогласно Приказа № 219 от 20.07.98 г.разрешен к применению в качестве изделия медицинского назначения (ТУ-9398-410-17253567-97).

В рамках клинических испытаний в 1997 г. проведено сравнительное исследование двух тест-систем: Amplicor MTB (производства фирмы Roche) и Политуб(НПФ Литех). Было проанализировано 56 проб мокроты больных туберкулезом легких. В таблице 2 приведены данные сравнительного исследования проб мокроты культуральным методом и методом ПЦР (диагностические наборы «Политуб» и «Amplicor MTB») в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам. Как следует из представленных данных, совпадение результатов исследования с применением наборов «Политуб», «AmplicorMTB» и культурального метода наблюдалось в 15 случаях из 23, в 8-ми случаях отмечено несовпадение результатов культурального и молекулярно-биологических методов исследования, в восьми случаях несовпадение результатов ПЦР-исследования при применении наборов «Политуб» и «AmplicorMTB». Удельный вес совпадений при выявлении МБТ данными тест-системами в целом был равен 87,3% (49 проб из 56).

Далее:

 

Глава 10. Удавление.

Древние майя.

Половые позиции.

Шаг 2: Ищите и находите изобилие в настоящем.

Любящий родитель заботится о ребенке.

Глава II. Условия существования патогенных микробов в воде..

Baryta carbonICa углекислый барий.

 

Главная >  Публикации 


0.1835