Главная >  Публикации 

 

Окрашивание белков в пааг



В заключение отметим, что при электрофорезе мембранных липопротеидов главная проблема связана с их растворением. Даже в 1%-ном ДДС-Na при 100° не удается добиться надежного растворения. Между тем липопротеиды хорошо растворяются в смеси 6 г глицина и 10 мл 98%-ной муравьиной кислоты. Электрофорез можно вести в 13 М НСООН (50%). Для этого полимеризуют гель в воде, потом его вынимают, вымачивают в 13 М НСООН и с каплей глицерина вставляют в трубку, диаметр которой на 0,1—0,2 мм больше, чем у той, которая использовалась при полимеризации. В ней и ведут электрофорез Mokrasch, 1978. В другом варианте электрофореза водонерастворимых белков в качестве рабочего буфера геля использовали смесь фенола, этиленгликоля и воды в соотношении 3:2:3 (масса/объем/объем). Мономерный акриламид реагирует с фенолом, поэтому полимеризацию ПААГ в пластинах проводили опять-таки в водной среде, которую затем путем вымачивания геля заменяли описанной выше смесью Pusztai, Watt, 1973.

Окрашивание белков в пааг

Обнаружение и локализацию белковых зон после их разделения электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуществляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как окрашенные полоски или пятна различной интенсивности, в зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вымачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания полос за это время белки иногда предварительно фиксируют осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или 50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию совмещают с окрашиванием, используя раствор красителя в .смеси уксусной кислоты и метанола или в ТХУ.

Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера геля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно менее прочно, чем с белками, поэтому от «фона» удается без особого труда избавиться «отмывкой» геля, например вымачиванием его в относительно большом объеме растворителя с несколькими сменами. Если отмывка идет только за счет диффузии красителя из геля, она занимает несколько часов, обычно ее ведут в течение ночи. Во избежание растворения осажденных белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто .в смеси с метанолом, который улучшает растворимость красителя. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37— 50°) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опасность ослабления окраски полос.

Все типы обычно используемых красителей для белков несут на себе электрический заряд того или иного знака, поэтому отРис. 28. Устройство для электрофоретической отмывки гелей Shortess, 1974 мывку геля можно еще ускорить, если в растворителе суспендировать немного ионообменной смолы, связывающей краситель и тем самым сдвигающей равновесие диффузии. Часто используют для этой цели смолу смешанного типа AG 501х8.

Наконец, процесс отмывки можно сократить до десятков минут, если воспользоваться электрофорезом. Электрическое поле накладывают на гель в поперечном направлении — перпендикулярно оси трубки или поверхности пластины. Не связанные с белками молекулы красителя благодаря своему заряду быстро выходят из геля. Разумеется, для этой цели нужно иметь специальный, хотя и очень простой, прибор для поперечного электрофореза. Такие приборы («дестейнеры») имеются в продаже, но их легко изготовить и в лаборатории.

Простое устройство для этой цели описано и схематически изображено на рис. 28 Shortess, 1974. На пластинку из нержавеющей стали с отогнутым концом кладут кусок поролона, смоченного 10%-ным раствором уксусной кислоты. Его помещают в ванночку и заливают таким же раствором до уровня чуть ниже верхней поверхности поролона. Ряд трубок или пластину геля кладут на поролон, накрывают фильтровальной бумагой, смоченной уксусной кислотой, и прижимают перфорированной алюминиевой пластинкой или сеткой, также с отогнутым концом. К отогнутым концам обеих пластинок присоединяют провода от источника тока; стальная пластинка служит анодом. Перфорации в катодной пластинке нужны для выхода пузырей газа. Через пластину геля размером 12х7х0,3 см нужно пропускать ток силой 0,6 А. Отмывка занимает 15—20 мин. Находящиеся в осадке белки и прочно связанный с ними краситель при непродолжительном поперечном электрофорезе остаются на своих местах в геле.

До сих пор речь шла о неспецифической окраске белков. Если в ходе электрофореза ферменты не утрачивают своей биологической активности, то их локализацию в геле можно осуществить с помощью специфической ферментативной реакции или цепи реакций, дающих окрашенные продукты. В этом случае гель вымачивают в растворе соответствующих субстратов. Разумеется, фиксировать белки осаждением в этом случае нельзя и приходится мириться с некоторым размыванием белковых полос. Впрочем, низкомолекулярные субстраты зачастую диффундируют в гель быстрее, чем довольно крупные молекулы красителей, и продолжительность вымачивания бывает можно сократить.

Иногда возникает необходимость вести наблюдение за миграцией белковых зон в ходе электрофореза. Для этого исходную смесь белков можно окрасить красителем «Remazol» Griffith, 1972, который ковалентно связывается с белком и мигрирует вместе с ним. Реакцию между белком и красителем проводят в присутствии ДДС-Na, в щелочной среде. Например, к 2 мг белка, растворенного в 0,2 мл 0,15 М NaCI с 0,2 М NazHPt^ и 10% ДДС-Na, добавляют краситель до концентрации 0,16% и прогревают при 56° в течение 20 мин. Для очистки от свободного красителя белок переосаждают ацетоном.

Чувствительность окрашивания белков многократно увеличивается при использовании перечисленных ниже флюоресцентных красителей. Многие из них связываются с белками или пептидами, в основном по концевым аминогруппам. Их также можно использовать для наблюдения за ходом электрофореза после предварительной обработки исходного препарата.

Рассмотрим теперь подробнее наиболее распространенные марки красителей и особенности их применения.

Кислые красители

Исторически для окраски белков в геле были прежде всего использованы давно апробированные промышленные красители для шерсти — сложные молекулы с несколькими ароматическими кольцами и заряженными группами. Механизм их взаимодействия с белками еще далеко не ясен. По-видимому, первоначальное связывание идет за счет кулоновского взаимодействия сульфогрупп красителей с положительно заряженными аминокислотными остатками в белке. Затем оно, вероятно, закрепляется ван-дер-ваальсовскими, водородными, а возможно, и гидрофобными связями.

Как уже упоминалось, для фиксации белковых полос окрашивание ведут в кислой среде. Какой бы буфер ни использовался при электрофорезе, к моменту окрашивания он замещается на довольно крепкий раствор (10% и более) уксусной кислоты или ТХУ, поэтому преимущественный заряд любого белка оказывается положительным за счет остатков лизина, аргинина и гистидина, так что для белков используются преимущественно кислые красители, несущие остатки сульфокислоты. Они сохраняют свой отрицательный заряд и при низких значениях рН.

В прошлом десятилетии широко использовали «амидошварц»—краситель с фирменным названием «Amido Black 10B» (сейчас его выпускают под названием «Naphthalene Black 12B»). Его растворяли до концентрации 1% в 7%-ном растворе уксусной кислоты. В настоящее время его вытеснил другой краситель—кумасси ярко-голубой («Coomassie brilliant blue», сокращенно СВВ). Этот краситель дает лучшую чувствительность и линейную зависимость интенсивности окраски от концентрации белка в более широком ее диапазоне. Краситель выпускают в двух модификациях: R-250 и G-250. Здесь для ориентировки приведена структурная формула второго из них. Структура СВВ R-250 отличается только отсутствием двух метальных групп. Фирма BDH сейчас выпускает эти красители под названиями «PAGE blue 83» и «PAGE blue G-90» соответственно.

Кумасси G-250 Обилие ароматических колец в структуре красителей типа СВВ делает их плохо растворимыми не только в воде, но и в разбавленной уксусной кислоте. Для улучшения растворимости к кислоте часто добавляют метанол. Обычно используют водные растворы, содержащие 9—10% уксусной кислоты и 40—45% метанола (по объему), однако рабочая концентрация СВВ R-250 в этой смеси составляет 0,1—0,25%, реже 0,5%. Иногда СВВ R-250 растворяют в 25%-, 50%-ной ТХУ или в смеси, содержащей 10% ТХУ и 25% изопропанола (остальное—вода). Возможны и другие варианты, не меняющие существа дела: краситель должен полностью раствориться в кислом растворителе, осаждающем белок. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать. Их наличие не. говорит о плохом выборе растворителя, так как Препараты красителя, изготавливаемые для промышленных целей, редко бывают чистыми.

Продолжительность окрашивания зависит от толщины и пористости геля и может варьировать от 2—3 до 12 ч. Для ускорения процесса можно окрашивать гель при 37°, а ванночку с расствором красителя покачивать. Отмывку от не связавшегося с белком красителя ведут, как описано выше, например вымачивая гель в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси, содержащей 7,5% уксусной кислоты и 5% метанола. В этих условиях растворимость красителя достаточна для вымывания его свободных молекул, а десорбция его с белка незначительна. Если электрофорез вели в присутствии высокой концентрации мочевины, то лучше отмывать смесью, содержащей 7,5% уксусной кислоты и 20% метанола.

Гель из трубки отмывают в пробирке, пластину геля— в ванночке. При окрашивании соотношение объемов жидкости и геля должно составлять примерно 3:1, при отмывке — 5:1 или даже 10: 1 с двумя-тремя сменами растворителя. Если в растворитель добавлена ионообменная смола, то его менять не нужно. Отмыв- ку можно вести поперечным электрофорезом, как подробно описано выше.

Окрашенный гель из трубки можно сканировать в специальном приборе или с помощью приставки, которой комплектуются сейчас многие продажные спектрофотометры. Не следует, впрочем, слишком полагаться на соотношение размеров пиков такой электрофореграммы при оценке количественного соотношения белков в полосах, так как связывание красителя зависит не только от концентрации, но и от химического состава и конформации белка.

Если электрофорез проводили в кварцевых трубках, то гели можно сканировать, не извлекая их из трубок, по ультрафиолетовому поглощению белков (или нуклеиновых кислот, что значительно легче).

В этом случае необходимо тщательно очищать или перекристаллизовывать акриламид для уменьшения его собственного поглощения в ультрафиолетовой области спектра.

Другая возможность количественной регистрации электрофореграммы заключается в денситометрировании его фотографии. В этом случае ошибка в оценке истинного соотношения количеств белка в полосах может еще усугубиться за счет нелинейности чувствительности фотопленки и других особенностей фотографического процесса.

Наиболее надежным способом количественных измерений является счет радиоактивности в белковых полосах при условии однородности радиоактивной метки по всем компонентам смеси и обеспечения полноты выхода счета, о чем будет подробнее сказано ниже.

После окрашивания СВВ R-250 можно качественно, но вполне надежно обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка. На порядок более высокую чувствительность окраски можно получить с помощью красителя СВВ G-250. Для этого используют относительно плохую его растворимость в хлорной кислоте. Готовят 0,04%-ный коллоидный раствор красителя в 3,5%-ном водном растворе НС104, фильтрованием освобождаются от крупных, не растворившихся частиц. В полученном коричневом растворе вымачивают гель в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Сорбция на белке сдвигает равновесие в сторону диссоциации коллоидных частиц; краситель связывается с белком и окрашивает его в синий цвет (коричневая окраска была обусловлена наличием коллоидных частиц). На геле при этом краситель не сорбируется. Синеватые полосы белка проступают на бледно-коричневом фоне геля уже через 30 мин. По истечении 1,5 ч гель переносят в 5%-ный раствор уксусной кислоты. Интенсивность окраски полос при этом увеличивается, а фон становится прозрачным и светло-голубым — часто его можно не отмывать Hoibrook, Leaver, 1976. Описан и другой вариант использования СВВ G-250: его растворяют сначала в 1 н. H2S04, а затем в 12%-ной ТХУ Blakesley, Boezi, 1977.

Для окрашивания гистонов после электрофореза иногда используют краситель «Fast green FCF» McMaster-Kaye, Kaye, 1974. Его можно использовать и для других белков. Он менее чувствителен, чем СВВ, но более надежен для количественных оценок содержания белка в полосах путем денситометрирования, так как при отмывке геля СВВ в большей степени, чем «Fast green», вымывается из белковых полос, причем иной раз неодинаково для различных белков Bertolini et al., 1976.

Следует отметить, что в случае плотных белковых полос при недостаточной продолжительности окрашивания можно столкнуться с артефактом — возникновением «двойной полосы». На самом же деле это одна полоса, интенсивно окрашенная с двух своих торцевых поверхностей.

Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом. Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электрофореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе формальдегида в 25%-ном этаноле с добавлением СВВ R-250 до 0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пептиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мостиков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть разительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных белков: гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном растворе формальдегида, что обеспечивает вытеснение ДДС-Na красителем. Отмывку гелей ведут в течение ночи в 3,5%-ном растворе формальдегида в 25%-ном этаноле Steck et al., 1980.

Другие красители и методы окрашивания

Определенные затруднения возникают при окраске кислых фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию анионными красителями. Конечно, можно использовать такие положительно заряженные (катионные) красители, как толуидиновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда несет на себе некоторое количество отрицательно заряженных остатков акриловой кислоты.

Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам, поэтому можно использовать ионы А13+ для блокирования зарядов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендована следующая смесь: 0,05% СВВ R-250+0,1 M A1(NO3)3+10% уксусной кислоты + 25% изопропанола + 1% Тритона Х-100. Отмывают гель, как обычно, в 7%-ной уксусной кислоте Hege-. nauer et al., 1977.

Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты можно окрасить одновременно красителем с выразительным фирменным названием «Stains-all», формула которого представлена ниже.

0,1%-ный маточный раствор этого красителя в формамиде можно хранить при 4° в темной бутыли в течение месяца. Его рабочая концентрация—0,0012% в 0,01 М Трис-НСl (рН 8,5) с 5% формамида и 25% изопропанола. Окрашивать гель следует в темноте, в течение ночи. Можно затем отмывать гель в воде, но делать это не обязательно, так как на свету находящийся в геле свободный краситель быстро выцветает, в то время как связанный с белком оказывается значительно более стойким. Замечательно, что разные по своей природе биополимеры окрашиваются при этом в различные цвета: гликопротеиды—в синий, белки — в красный, липиды — в желто-оранжевый, ДНК — в синий, а РНК — в голубовато-пурпурный. Однако по чувствительности этот универсальный краситель заметно уступает специализированным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДДС-Na, который из-за этого приходится отмывать после электрофореза, вымачивая гель в течение 18—36 ч в 25%-ном растворе изопропанола King, Morrison, 1976.

Если примириться с некоторой диффузией полос во время окрашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих случаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаимодействия. В области нейтральных рН такие кислые красители, как СВВ, бромфеноловый синий и «Fast green», заряжены отрицательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже рН 3,5. Щелочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд (рI>9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях можно красить щелочными красителями, а щелочные—кислыми. Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтрализуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (рН 7) до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин, затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси метанол—вода (1 : 2), что стабилизирует окраску. Окрашенные гели хранят в разбавленных водных растворах красителей во избежание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика азид натрия до концентрации 0,01% Ruchel et al., 1978.

Недавно был предложен принципиально новый способ окраски белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по утверждению авторов, на два порядка более высокую чувствительность, чем СВВ R-250 Merril et al., 1979. Белки окрашивают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, растворенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель предварительно обрабатывают формальдегидом. После первой обработки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно концентрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и, наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формальдегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окрашивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением серебра в фотографическом процессе, так как «передержанный» гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии.

Несмотря на свою огромную чувствительность, предложенный способ достаточно сложен и связан с расходом дорогостоящего нитрата серебра, поэтому в середине 1980 г. другая группа авторов опубликовала упрощенную методику высокочувствительной окраски белков серебром, дающую, по-видимому, такие же результаты Oakley et al., 1980. Ввиду перспективности этого метода цитируем его подробно.

Все растворы готовят на бидистилляте, а работу ведут в перчатках. Приведенный ниже режим обработки соответствует пластинам размером 140x x140x0.8 мм; для более толстых гелей продолжительность обработки на каждом этапе надо увеличить. При всех процедурах, кроме одной, используют осторожное перемешивание растворов на ротационной мешалке («New Brunswick gyrotory shaker», модель 2) со скоростью 40 об/мин. Ниже описаны соответствующие процедуры.

Гель вымачивают в течение 30 мин в 10%-ном водном растворе глутарового альдегида, споласкивают в течение 10 мин в 0,5—1 л воды с двумя сменами и оставляют для набухания в воде не менее чем на 2 ч. Затем воду сливают и заливают гель свежеприготовленным раствором аммиачного серебра. Для получения 100 мл этого раствора добавляют 1,4 мл свежего концентрированного раствора аммиака к 21 мл 0,36%-ного раствора NaOH, а затем с энергичным перемешиванием медленно прибавляют 4 мл 19,4%-ного раствора азотнокислого серебра (20 г AgNO3+100 мл воды). При этом может временно образоваться коричневый осадок. После его растворения добавляют воду до объема 100 мл. Для создания хорошей, ровной окраски и во избежание прилипания геля ко дну надо, чтобы он свободно плавал в ванночке размером 20Х20 см со 150 мл раствора аммиачного серебра. Скорость перемешивания в это время следует увеличить до 75 об/мии. Окрашивание должно длиться не более 15 мин, чтобы серебро не успело осесть на поверхности геля. Так как раствор аммиачного серебра при высыхании может взрываться, после его использования серебро осаждают в виде AgCl подкислением НС1. Гель вынимают из раствора и промывают водой в течение 2 мин. Чтобы он не прилип к кювете, здесь и на следующем этапе следует не сливать жидкость, а переносить его из кюветы в кювету. Затем гель переносят в свежеприготовленный раствор, содержащий 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида. (разбавлен из продажного 3'8%-ного формальдегида в 10%-ном метаноле); при этом и проступают полосы белков. Гель вынимают, когда фон только начинает темнеть, и промывают водой в течение часа с тремя сменами при перемешивании. Если концентрация ПААГ превышает 10%, то фон может оказаться темным. Он уменьшается в случае предварительной фиксации белков в 10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола в течение 30 мин и последующей промывки геля в 7%-ной уксусной кислоте с 5% метанола в течение ночи.

Далее:

 

5. Психология дружбы.

Магические пассы для работы с инвентарным списком..

Плеврит.

Глава 2. Десять принципов эффективного тренинга..

Ерошина В.А., Бузунов Р.В. Диагностика и лечение харапа и синдрома обструктивного апноэ сна.

Асцендент в медицинском гороскопе.

3. Эпигенетическая теория развития личности. Эрика эриксона..

 

Главная >  Публикации 


0.0401